СЗМ Раман Нано ИК системы
Модульные СЗМ
Автоматизированные СЗМ
Специализированные СЗМ
 
 

Примеры применений (Архив)

Исследование структуры и организации макромолекул с помощью АСМ.

Исследование структуры и организации макромолекул с помощью АСМ.

Содержание

  • Введение
  • Приготовление образца
  • Измерения
  • Амплитудные кривые
  • Зависимость от амплитуды
  • Выбор рабочей амплитуды
  • Результаты
  • Литература

Введение
Методы атомно-силовой микроскопии позволили нам визуализировать пентамерную структуру иммуноглобулинов IgM и доменную структуру иммуноглобулинов IgG. Вместе с полученными с помощью АСМ данными об условиях тетрамеризации рибосом-инактивирующих белков второго типа (РИБ II) эти результаты вносят вклад во многие исследования касающиеся биологии РИБ II [1, 2], а также исследования взаимодействиий антиген-антитело [3, 4] и  лектин-лиганд [2, 5, 6]. 

Приготовление образца
Растворы токсинов и антител были разбавлены в фосфатно-солевом буфере до концентраций 0.5-2 мкг/мл. На свежесколотую подложку слюды наносили каплю раствора объемом 10 мкл и инкубировали в течение 1 минуты. Затем образец отмывали три раза в деонизованной воде и обдували азотом.

Измерения
Использовали полуконтактный метод АСМ.
Одним из достоинств полуконтактного  метода является уменьшение латеральных сил взаимодействия между зондом и образцом по сравнению с контактным методом АСМ. Вертикальные силы также могут быть снижены выбором подходящих значений  начальной и рабочих амплитуд колебаний зонда, а также выбором силовой константы кантилевера.
Отмеченные достоинства полуконтактного метода АСМ важны при изучении мягких биологических объектов, таких, например, как адсорбированные на слюду макромолекулы, слабо закрепленные на подложке.
Для исследования молекул использовался сканирующий зондовый микроскоп Solver P47H, в котором реализована схема сканирования зондом, оборудованный приставкой для проведения измерений с атомарным разрешением. Для экспериментов использовались кремниевые зондовые датчики серии NSG11S с двумя кантилеверами с типичной силовой константой 5.5 Н/м и 10.5 Н/м. Начальная амплитуда колебаний зонда лежала в диапазоне 5-15 нм, рабочая амплитуда лежала в диапазоне 1-10% от начальной амплитуды. Для каждого зондового датчика эти значения определялись экспериментально с помощью амплитудных кривых.

Амплитудные кривые
При работе полуконтактным методом для настройки оптимального разрешения и контраста удобно использовать зависимость амплитуды колебаний зонда от расстояния зонд-поверхность.
На рисунках ниже показаны амплитудные кривые, полученные на участках слюды, свободных от молекул. Левая зависимость получена для зондового датчика с резонансной частотой 248 кГц и начальной амплитудой колебаний зонда 15 нм, правая – для  зондового датчика с резонансной частотой 181 кГц и начальной амплитудой колебаний зонда 7 нм.
Кривые характеризуются наличием скачкообразного изменения амплитуды. Такой скачок на амплитудной кривой отображает переход между двумя режимами взаимодействия системы зонд-образец:  режимом притяжения и режимом отталкивания [7].
Используя эти кривые можно определить начальную амплитуду Ао колебаний зонда и подобрать рабочую амплитуду Asp для получения наилучшего изображения.
 

         
Зависимость от амплитуды

а)

б)

Рис. 1 Изображение, полученное при начальной амплитуде a)10 нм, б)34 нм.           

Выбор рабочей амплитуды
Получаемое изображение зависит от выбора значения рабочей амплитуды  Asp. В случае амплитуды близкой к нулю (режим отталкивания), так же как и в случае амплитуды, слегка меньше начальной (режим притяжения), удается получать изображения с хорошим контрастом  и разрешением.
Если же рабочая амплитуда Asp выбрана в области перехода или чуть выше, изображение становится нестабильным и частично инвертированным.

В отличие от результатов, полученных в работе [8] мы нашли, что режим отталкивания так же пригоден для изучения молекул. Более того, режим отталкивания более стабилен, чем режим притяжения и дает большее разрешение. Различие результатов, полученных нами и результатов работы [8]  можно объяснить тем, что мы использовали зонды меньшей жесткости (5 Н/м и 11 Н/м вместо 25-50 Н/м).

а) Asp=0.1 nA

б) Asp=1.93 nA

 

 

в) Asp=2.1 nA

г) Asp=2.63 nA

 

 

Рис. 2 Изображения антител полученные при разных рабочих амплитудах (a-г).

Результаты

  1. Изображения токсинов (рицина, агглютинина рицина, вискумина) и антител IgG1 и IgM.
  2. Оценка эффективного размера молекул рицина и антител IgG.

 Токсины

a)

b)


в)

Рис. 3 Изображения токсинов.

а) Изображение молекул рицина. Рицин – растительный рибосом-инактивирующий белок второго типа (РИП II). Присутствует в семенах клещевины (Ricinus communis). Состоит из двух субъединиц (А и В), соединенных дисульфидной связью. Молекулярные массы субъединиц – 30 кДа. А-субъединица (active) способна модифицировать рибосомальную РНК, что приводит к остановке синтеза белка.  В-субъединица (binding) обусловливает  связывание токсина с клеточной мембраной и его доставку к внутриклеточной мишени – рибосоме. Связывание происходит за счет взаимодействия лектиновых центров В-субъединицы с углеводной частью клеточных рецепторов.
б) Изображение молекул агглютинина рицина. Агглютинин рицина – второй РИБ из семян клещевины. В отличие от рицина этот белок представлен в виде тетрамера (две В- и две А-субъединицы), образованного за счет ковалентного взаимодействия между двумя А-субъединицами токсина.
в) Изображение молекул вискумина. Вискумин  - РИБ, продуцируемый в листьях омелы (Viscum album) и имеющий структуру и свойства, сходные со свойствами рицина. Отличия – спектр сахаров, узнаваемых В-субъединицами токсинов.

Антитела

a)

b)

в)

Рис. 4 Изображения антител IgG1 изотипа(а-в).

Использовали различные моноклональные антитела изотипа IgG1, имеющие молекулярную массу 150 кДа:
а) MNA9 – моноклональное антитело, взаимодействующее с А-субъединицей вискумина и с цельным вискумином;
б) 1RK2 – моноклональное антитело, способное взаимодействовать с изолированной А-субъединицей рицина;
в) 3F12 – гликозилированные моноклональные антитела. Углеводная часть данных гликозилированных моноклональных антител содержит терминальную галактозу. Антиген-связывающие центры этих антител не взаимодействуют с токсинами, а связывание между такими антителами и токсинами происходит по принципу «лектин-лиганд».

Рис. 5 Изображения антител IgM изотипа.

Использовали антитела IgM изотипа из сыворотки крови человека, имеющие молекулярную массу около 900 кДа. Оценка эффективного размера молекул рицина и атител

Программное обеспечение зондовых микроскопов компании NT-MDT содержит инструмент "Grain analysis", который позволяет производить статистическую обработку изображений. Мы использовали эту программу для определения геометрических размеров молекул рицина и антител IgG1 изотипа.
Измерения размера молекул производились на основе сканов снятых с шагом 10 ангстрем и содержащих изображения 50-ти молекул рицина и 85-ти молекул антител 1RK2.  В качестве оценочного параметра был взят эффективный размер объекта Dv – корень кубический из объема.

Ссылки

[1] Sandvig K., Grimmer S., Lauvrak S.U., Torgersen M.L., Skretting G., van Deurs B., Iversen T.G. // Pathways followed by ricin and Shiga toxin into cells // Histochem. Cell Biol., v. 117, n. 2, pp. 131-141, 2002
[2] Moisenovich M., Tonevitsky A., Agapov I., Niwa H., Schewe H., Bereiter-Hahn J. // Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells // Eur. J. Cell Biol., v. 81, n. 10, pp. 529-538, 2002
[3] Touhami A., Othmane A., Ouerghi O., Ouada H.B., Fretigny C., Jaffrezic-Renault N. // Red blood cells imaging and antigen-antibody interaction measurement // Biomol. Eng., v. 19(2-6), pp. 189-193, 2002
[4] Tonevitsky A.G., Agapov I., Temiakov D., Moisenovich M., Maluchenko N., Solopova O., Wurzner G., Pfueller U. // Study of heterogeneity of lectins in mistletoe preparations by monoclonal antibodies to their A-subunits // Arzneimittelforschung, v. 49, n. 11, pp. 970-975, 1999 [5] Fritz J., Katopodis A.G., Kolbinger F., Anselmetti D. // Force-mediated kinetics of single P-selectin/ligand complexes observed by atomic force microscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 95, n. 21, pp. 12283-12288, 1998
[6] Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Shamshiev A.T., Pohl E., Pohl P., Palmer R.A., Kirpichnikov M.P. // The role of structural domains in RIP II toxin model membrane binding // FEBS Lett., v. 402, n. 1, pp. 91-93, 1997
[7] Ricardo Garcia and Alvaro San Paulo // Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy // Phys. Rev. B., v. 60, n. 7, pp. 4691-4697, 1999
[8] Alvaro San Paulo and Ricardo Garcia // High-Resolution Imaging of Antibodies by Tapping-Mode Atomic Force Microscopy: Attractive and Repulsive Tip-Sample Interaction Regimes // Biophysical Journal, v. 78, pp. 1599-1605, 2000

Результаты сканирования зависят от начальной амплитуды Ао колебаний зонда. Наилучшие изображения получаются при амплитуде в диапазоне 5-15 нм. Увеличение величины начальной амплитуды приводит к снижению разрешения. 

 
 
Copyright © 2015 - 2017, NT-MDT SI