СЗМ Раман Нано ИК системы
Модульные СЗМ
Автоматизированные СЗМ
Специализированные СЗМ
 
 

Примеры применений (Архив)

Изучение клеток крови

Мазок Крови 

Б.Н. Зайцев
Государственный Научный Центр Вирусологии и Биотехнологии ВЕКТОР, 
Кольцово, Новосибирская обл., 630559, Россия.

Цель исследований


Подготовка измерений.
Подготовка образца
Выбор методик измерений
Выбор зондовых датчиков
Специальные условия измерений

Проведение измерений

Результаты: Анализ, Обработка, Проблемы и Перспективы


 

Артефакты Приготовления
Суспензия
Артефакты Сканирования

Метод Рассогласования

 

Вирус-клеточное взаимодействие

Изменение формы
Строение Мембраны
Вирусы на мембране

Цель исследований.

Целью исследований  было изучение изменений формы клеток крови (в основном эритроцитов) и строения их мембран в процессе взаимодействия эритроцитов с вирусами.  На примере этого исследования показаны возможности АСМ для изучения клеток  крови и их изменений в различных физиологических условиях  (болезни, действие лекарств).

Подготовка образца.

При исследовании биологических препаратов процесс подготовки образцов имеет решающее значение. Для исследований на воздухе применялись две основных схемы приготовления препаратов.
Метод мазка. Для исследования пригоден простой мазок крови, приготовленный на предметном стекле стандартным для клинической лаборатории методом. Капля крови (10-20 мкл) наносится на чистое предметное стекло и размазывается вторым стеклом. Толщина мазка убывает вдоль направления размазывания. В световом микроскопе, на столике которого смонтирована сканирующая головка прибора Solver BIO, выбирается область, где клетки крови расположены в один слой. Препарат готов к исследованию практически сразу и не требует дополнительных манипуляций.
Нанесение клеток из суспензии.  Образец  представлял собой суспензию клеток крови (в основном эритроцитов) в фосфатном буфере (рН 7,0). Перед сорбцией клетки фиксировали  добавлением параформальдегида до конечной концентрации 2% и через 2 часа переводили в дистиллированную воду, доведя концентрацию до 108  штук/мл. Каплю суспензии    (5-10 мкл) наносили на предметное стекло размером  3х3 см и сушили на воздухе. Стекло крепилось к столику микроскопа с помощью двухстороннего скотча.

Выбор методик измерений.

В зависимости от поставленных задач клетки крови можно исследовать в воздушной среде или в жидкости (солевом буфере).
Являясь существенно менее трудоемким по сравнению с жидкостным, воздушный режим обеспечивает высокое разрешение, позволяет наблюдать целостность и характер повреждений мембраны. Как показано [1,2], обезвоживание практически не искажает форму эритроцитов и строение их мембраны. Именно на  высушенных образцах получали изображение спектринового скелета мембраны [1].  Сухой режим позволяет  регистрировать тонкие нарушения мембранной структуры, то время как при работе в жидкости пространственное разрешение ограничено [3]. Поэтому был выбран воздушный режим.
Для измерений на воздухе подходят как ТМ, так и контактный метод. Оба режима допускают применение error mode с близкими результатами. Параллельно ТМ позволяет получать изображения в фазовом контрасте, дающие сведения об упругости объекта, а  контактный метод дает возможность получить изображение в режиме латеральных сил (сил трения) и позволяет измерить упругость объекта (в режиме снятия силовых кривых). В данном случае эритроциты на воздухе исследовали ТМ.
При получении изображений мембраны с высоким разрешением параллельно получали два изображения: в режимах HIGH и MAG (error mode).
Использование режима фазового контраста при работе на воздухе не давало дополнительной информации и, поэтому, не применялось. 

Выбор зондовых датчиков.

Измерения в ТМ проводили зондами NSG11. В контактном режиме на воздухе использовались зонды CSC11.
Так как обезвоженные эритроциты достаточно стабильны,  режимы на воздухе к выбору зонда не слишком критичны. Похожие по качеству результаты получались в ТМ и контактном режиме с различными зондами. Для жидкостного режима очень важно выбрать наиболее мягкий зонд для минимизации силы взаимодействия зонд-эритроцит. В противном случае эритроциты в процессе сканирования могут оторваться от подложки. 

Специальные условия измерений

Исследования проводились на наборе образцов, имеющих разное происхождение, с разным временем воздействия вируса на эритроциты. Для фиксации времени взаимодействия проводилась обработка суспензии эритроцит-вирус добавлением к ней параформальдегида до конечной концентрации 2%. Чтобы уменьшить скорость вирус-клеточного взаимодействия  процесс приготовления образцов до этапа фиксации проводился при температуре 4-6оC.

Проведение измерений.

Исследовании на воздухе проводилось в полуконтактном режиме. В оптическом микроскопе «Биолам», на столике которого размещен сканер, оценивалось состояние эритроцитов и выбиралось поле для изучения. Благодаря достаточно большой площади скана (70х70 мкм), при первом сканировании в кадр попадало значительное число (десятки) эритроцитов, что давало возможность оценить их состояние (изменения формы),  выбрать объект для подробного исследования, а также переходить с одного объекта на другой не поднимая зонд от подложки.  При больших увеличениях одновременно получали сканы в режимах HIGH  и MAG. 

Результаты измерений:
Анализ, Обработка, Проблемы и Перспективы.

Обзорные сканы в IC mode  показывают, что нанесение клеток на поверхность подложки методом мазка  искажает форму эритроцитов. Тем не менее, этот способ нанесения очень прост и дает адекватную картину распределения клеток по размерам.  В мазках кроме эритроцитов можно встретить другие типы клеток,  наблюдаются так называемые «монетные столбики»,  которые описаны  в медленно циркулирующей крови и видны  под световым микроскопом.
 Использование метода «суспензии» более универсально по применению, однако может привести к появлению артефактов приготовления.
Сравнение обзорных сканов с контрольного и опытных образцов  дают представление об изменении формы эритроцитов в процессе их взаимодействия с вирусными частицами. Так эритроциты птиц не меняются при их контактах с использованными нами  частицами вируса гриппа и парвовируса, в то время как эритроциты макаки резус изменяются очень быстро и очень сильно. error mode дает возможность выявить тонкую структуру мембраны  на фоне резких изменений высоты. В этом режиме хорошо различимы нарушения и дефекты на поверхности эритроцитов макаки, вызываемые влиянием вирусных частиц. На контрольных образцах в error mode различается решетка из мембранного белка спектрина, описанная в литературе [1,2]. На эритроцитах птиц наблюдаются сорбированные вирионы гриппа.
По литературным данным сорбция на подложку из суспензии и обезвоживание эритроцитов не приводит к изменениям их формы и строения поверхности мембраны. Сравнение формы искажений, вызываемых разными причинами (влияние химических веществ, ионной силы и рН раствора,  болезнь, действие вирусных частиц, механические повреждения) см [8]. дает возможность определить физико-химические механизмы, действующие в каждом случае. В свою очередь эта информация  поможет разработать методы лечения или создать эффективные лекарства и вакцины.
Изучение эритроцитов методом АСМ может применяться и для прямой диагностики болезней крови [9].

Ссылки

1.Minoru Takeuchi,* Hiroshi Miyamoto,# Yasushi Sako,§ Hideo Komizu,# and Akihiro Kusumi Structure of the Erythrocyte Membrane Skeleton as Observed by Atomic Force Microscopy Biophys J, May 1998, p. 2171-2183, Vol. 74, No. 5.
2. Zhang, P. C., Bai, C., Huang, Y. M., Zhao, H., Fang, Y., Wang, N. X. and  Li, Q. (1995). "Atomic force microscopy study of fine structures of the entire surface of red blood cells." Scanning Microsc. 9(4): 981-989; discussion 1009-1010
3. Nowakowski R, Luckham P, Winlove P Imaging erythrocytes under physiological conditions by atomic force microscopy.
 Biochim Biophys Acta 2001 Oct 1;1514(2):170-6
4. Zaitsev B.N., Durymanov A.G., Generalov V.M. Atomic Force Microscopy of the Interaction of Erythrocyte Membrane and Virus Particles. Proc. Intern. Workshop "Scanning Probe Microscopy-2002", p. 211-213. Nizhny Novgorod, 03.03-06.03.2002
5. Ohta Y, Okamoto H, Kanno M, Okuda T Atomic force microscopic observation of mechanically traumatized erythrocytes.. Artif Organs 2002 Jan;26(1):10-7
6. Cheng Y, Liu M, Li R, Wang C, Bai C, Wang K. Gadolinium induces domain and pore formation of human erythrocyte membrane: an atomic force microscopic study.  Biochim Biophys Acta 1999 Oct 15;1421(2):249-60
7. Girasole, M., Cricenti, A., Generosi, R., Congiu-Castellano, A., Boffi,  F., Arcovito, A., Boumis, G. and Amiconi, G. (2000). "Atomic force   microscopy study of erythrocyte shape and membrane structure after     treatment with a dihydropyridinic drug." Appl. Phys. Letters. 76(24):   3650-3652.
8. Girasole M, Cricenti A, Generosi R, Congiu-Castellano A, Boumis G, Amiconi G. Artificially induced unusual shape of erythrocytes: an atomic force microscopy study.  J Microsc 2001 Oct;204(Pt 1):46-52
9. O'Reilly M, McDonnell L, O'Mullane J. Quantification of red blood cells using atomic force microscopy. Ultramicroscopy 2001 Jan;86(1-2):107-12
 

 
 
Copyright © 2015 - 2017, NT-MDT SI