СЗМ Раман Нано ИК системы
Модульные СЗМ
Автоматизированные СЗМ
Специализированные СЗМ
 
 

Примеры применений (Архив)

АСМ-исследование биополимеров. Влияния обводненности на морфологические особенности молекул коллагена.

АСМ-исследование биополимеров. Влияния обводненности на морфологические особенности молекул коллагена.
 
Гущина Ю.Ю,  Плохов Р.Г.
 
Научно-образовательный центр “Физика твердотельных наноструктур”
Нижегородского государственного университета им. Лобачевского. 
 
Введение.
Коллаген - самый распространенный естественный полимер и главный белковый компонент межклеточного вещества соединительных тканей всех типов. Коллаген – фибриллярный белок, т. е., имеет нитеподобную структуру.
Согласно одной из хорошо разработанных концепций кожной чувствительности,  морфологические изменения коллагеновых фибрилл при изменениях температуры оказывают непосредственное влияние на импульсную активность нервных окончаний в коже, что является основой формирования сенсорных кодов холода и тепла.
Исследование структуры коллагена представляется весьма интересной задачей для биологов. Использовать для этих целей оптический микроскоп не представляется возможным вследствие недостаточного разрешения метода. Широко применяемый метод электронной микроскопии позволяет разглядеть морфологические особенности молекул с достаточным разрешением, но не позволяет достоверно определить латеральные размеры этих особенностей и оценить шероховатость поверхности. Кроме этого приготовление образцов и исследование методом электронной микроскопии процесс длительный и сложный, требующий большого количества реактивов и условия вакуума. Биологические образцы фиксируют, высушивают и покрывают тонкой пленкой металла. Такое одномоментное приготовление препарата исключает возможность динамического наблюдения за изучаемым объектом. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) не требует сложной подготовки образцов и позволяет исследовать “живой” биологический препарат в разных средах с нанометровым разрешением.
Фундаментальная структурная единица коллагеновой фибриллы – тропоколлаген. Составляющие тропоколлаген три полипептидные цепочки удерживаются нековалентными связями. В их первичной структуре не мене 1/3 занимают т. н. -Gly-Pro-hPro- триплеты – последовательно следующие остатки глицина, пролина и гидроксипролина. Участки полипептидной цепи, богатые этими триплетами, обладают, согласно данным рентгеноструктурного анализа и ядерно-магнитного резонанса, кристаллично-подобными свойствами. Эти участки перемежаются аморфными участками, богатыми тяжелыми заряженными аминокислотными остатками. Из числа последних особо следует выделить гидроксилизин, являющийся, наряду с гидроксипролином, уникальным компонентом коллагена. Именно благодаря гидроксилизину возникают ковалентные сшивки между фибриллами тропоколлагена, и в результате образуются все более и более сложные фибриллярные образования вплоть до конечных толстых фибрилл или пучков.
 
Рис. 1 Изображение пучков коллагеновых фибрилл, полученное с помощью
зондового микроскопа Solver Bio.
Хорошо просматривается
поперечная исчерченность фибрилл.
 
Согласно последним структурным исследованиям [1] , молекулы тропоколлагена, расположенные ближе к периферии фибриллы, связаны большим количеством ковалентных связей, нежели центральные тропоколлагеновые молекулы, в связи с чем фибрилла в целом обладает жестким поверхностным слоем и более мягкой сердцевиной. Наконец, взаимное заслонение концевых участков тропоколлагеновых молекул при их ассоциации в фибриллу обуславливает характерную исчерченность коллагеновых фибрилл, хорошо видную на АФМ-картинках.  Эта периодичность имеет совершенно четкую количественную характеристику – величина одного периода составляет примерно 67 нм.
Абсолютное большинство исследований коллагена с помощью АСМ проводили на предварительно высушенных образцах. Но общеизвестно, что коллаген в нативном состоянии удерживает очень большое количество воды: на 100 г сухой массы коллагена приходится 180 г воды. При изменениях гидратной оболочки фибрилл возможно изменение их геометрических параметров.
 
Цель исследования.
Выявление морфологических изменений молекул коллагена при его обводненности используя СЗМ и исследование внутренней структуры фибрилл коллагена, используя более “жесткий” режим сканирования зондовым микроскопом.
 
Подготовка образцов.
Использовался коллаген сухожилий хвоста крыс, растянутый на поверхности предметного стекла.
При исследованиях в жидкости фибриллы коллагена обнаруживали плохую адгезию к поверхности подложки. Для фиксирования молекул поверхность стекла предварительно обрабатывалась 0.1 % раствором альцианового синего, что придавало подложке положительный заряд.

Методика исследований.
Исследования поверхности макромолекул проводили на сканирующем зондовом микроскопе Solver Bio NT-MDT.

  • Сканирование фиксированных препаратов методом АСМ на воздухе. Для сканирования высушенных фибрилл на воздухе был выбран полуконтактный метод, так как при использовании контактного метода наблюдается увлечение биологического препарата зондом. Частота развертки сканирования выбиралась порядка 1-1.5 Hz.
    Использовались: неконтактные кремниевые зонды серии NSG11 (NT-MDT) жесткостью порядка 5 Н/м, радиусом закругления 10 нм, аспектное отношение 3:1, неконтактные зонды «вискерного» типа серии NSC05(NT-MDT) жесткостью порядка 11 Н/м, радиусом закругления 10 нм, аспектное отношение 10:1.
  • Сканирование обводненных молекул методом АСМ в жидкой среде проводилось на предметном стекле в капле дистиллированной воды. Для сканирования обводненных фибрилл также был выбран полуконтактный режим сканирования, но более “мягкими” зондами. Частота развертки сканирования составляла примерно 0.5 Гц.
    Использовались: специально затупленные контактные кремниевые зонды серии СSG11 (NT-MDT) жесткостью 0,03 Н/м, с радиусом закругления примерно 30 нм и резонансной частотой в пределах 15-40 KГц.
  • Специальная подготовка зондов для исследований в жидкости. Зонды СSG11 серии предварительно затуплялись сканированием кремниевого образца в контактном режиме, задавая большое значение величины изгиба кантилевера - в 3-5 раз больше чем при исследованиях с применением контактной методики (3-5nA).

Результаты исследований.  

  • При исследованиях высушенных препаратов на воздухе величина периодичности составляла порядка 67 нм (Рис.2), что согласуется с литературными данными.
Рис. 2 Изображение и профиль участка высушенной коллагеновой фибриллы
на предметном стекле. Получено в полуконтактном режиме сканирования с использованием
неконтактных зондов серии NSG11. Хорошо разрешается поперечная исчерченность фибриллы.
 
  • При сканировании фибрилл в жидкости мы обнаружили, что период исчерченности составлял примерно 54-57 нм. Кроме того, при подробном рассмотрении выявилась “тонкая” структура – каждый пик оказывался двойным, что хорошо наблюдается на поперечном сечении (Рис. 3). Наличие этого можно объяснить как обводнением фибриллы, так и выявлением внутренней структуры вследствие большего воздействия на мягкую гидратированную молекулу со стороны зонда зондового микроскопа.
Рис. 3 Коллагеновая фибрилла на предметном стекле в жидкости.
Изображение получено в полуконтактном режиме сканирования с использованием
контактных зондов серии CSG11. Наблюдается поперечная исчерченность поверхности
фибриллы и выявляется дополнительная “тонкая” структура каждого периода,
что особенно хорошо видно по сечения вдоль фибриллы. 
 
  • При исследовании в водной среде наблюдается деформация фибриллы – размазывание периферической части по поверхности подложки и смещение более “твердой” внутренней части в направлении быстрого сканирования (показано стрелкой на Рис. 4). Это подтверждает предположение о двухслойной структуре молекулы коллагена [1]. Однако из наших наблюдений ясно, что именно сердцевина фибриллы имеет большую плотность по отношению к периферической. Этот вывод согласуется с данными рентгеноструктурного анализа [2], на основе которых предполагали, что коллагеновые фибриллы по структуре напоминают жидкие кристаллы, высокоорганизованные в центре и менее организованные на периферии.
Рис. 4 Деформированная коллагеновая фибрилла на предметном стекле в жидкости.
Изображение получено в полуконтактном режиме сканирования контактными зондами серии CSG11.
Наблюдается размазывание периферической части по поверхности подложки и смещение
более “твердой” сердцевины в направлении быстрого сканирования (показано стрелкой).
 
  • Использование зондов «вискерного» типа. Для лучшего разрешения морфологических особенностей высушенных фибрилл мы использовали зонды «вискерного» типа (Рис. 5). Раздвоение пиков не обнаруживалось, но, возможно, это связано с изменениями гликозаминогликанового окружения фибрилл, т. к. гликозамингликаны – высокосульфатированные полисахариды – ковалентно связаны с коллагеном и, в зависимости от условий среды, могут маскировать или демаскировать тонкую структуру фибрилл.  

 

а) б)

Рис. 5 Изображение участка высушенной коллагеновой фибриллы на предметном стекле
в полуконтактном режиме сканирования.
а) – изображение получено зондом серии NSG11 с аспектным отношением 3:1,
б) - изображение получено зондом серии NSC05 с аспектным отношением 10:1.
Очевидно, что с увеличением аспектного отношения применяемого зонда
существенно повышается разрешение морфологических особенностей.

Заключение.
Проведены исследования морфологических особенностей коллагеновых фибрилл на воздухе и в жидкости. Периодичность исчерченности на высушенных образцах составляет 67 нм, в жидкости 54-57 нм. Это можно объяснить изменением пространственной ориентации тропоколлагена, обусловленной обводнением.
Молекулы коллагена имеют двухслойную структуру, причем плотность тропоколлагеновых молекул увеличивается от периферии к центру, что было установлено ранее методом рентгеноструктурного анализа. СЗМ измерения при более “жестком сканировании” подтверждают этот факт.
Можно утверждать, таким образом, что сканирующий зондовый микроскоп позволяет исследовать не только поверхностную морфологию биополимеров типа коллагена, но и “прощупывать” их внутреннюю структуру.

Литература
 

  1. Thomas Gutsmann, Georg E. Fantner, Manuela Venturoni, Axel Ekani-Nkodo, James B. Thompson, Johannes H. Kindt, Daniel E. Morse, Deborah Kuchnir Fygenson and Paul K. Hansma. Evidence that Collagen Fibrils in Tendons Are Inhomogeneously Structured in a Tubelike Manner. Biophysical Journal, Vol 84, 2593-2598.
  2. DJ Hulmes, TJ Wess, DJ Prockop and P Fratzl. Radial packing, order, and disorder in collagen fibrils. Biophysical Journal, Vol 68, 1661-1670.

 

 
 
Copyright © 2015 - 2017, NT-MDT SI