СЗМ Раман Нано ИК системы
Модульные СЗМ
Автоматизированные СЗМ
Специализированные СЗМ
 
 

Примеры применений (Архив)

Микроскопия ДНК

Протоколы приготовления образцов молекул ДНК для измерения методом АСМ М. Н. Савватеев
 

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) в настоящее активно используется для изучения структурных особенностей биологических макромолекул (белков, ДНК), поскольку позволяет получать изображения с разрешением в несколько нанометров [1-3]. Наряду с исследованием сухих образцов, АСМ позволяет исследовать молекулы и в буферных растворах.
Для получения изображений методом АСМ, исследуемые объекты должны быть зафиксированы на какой-либо поверхности. При исследовании молекул ДНК в качестве подложки обычно используется кристаллическая слюда, поверхность которой является атомарно-гладкой. Для того чтобы прикрепить отрицательно заряженные молекулы ДНК на слюду, поверхность которой в воде также имеет отрицательный заряд, существует ряд методов, обзор которых приведен в данной заметке.  Приводимые в качестве иллюстраций АСМ изображения были получены на приборах серии Solver и Ntegra, «полуконтактным» методом на воздухе и в жидкости.

1. Добавление ионов двухвалентных металлов
Наиболее простым способом является добавление в буфер ионов двухвалентных металлов, которые играют роль мостиков между отрицательно заряженными поверхностью слюды и молекулой ДНК. Согласно работе [4], для крепления молекул ДНК наиболее подходят ионы никеля, кобальта и цинка, они обеспечивают надежное связывание с поверхностью слюды, достаточное для проведения измерений в жидкости.
Для приготовления образца препарат ДНК разводят до концентрации около 1 мкг/мл в буфере, содержащем 5мМ HEPES и 1-5 мМ NiCl2. На слюду наносят каплю раствора, инкубируют ее 5 минут и измеряют в буфере (рис. 1а), либо промывают в воде, сушат и измеряют на воздухе (рис. 1б).

а б
Рис 1.  АСМ изображения образца кольцевой плазмидной ДНК pEGFP, приготовленного с помощью ионов никеля. Изображение (а) получено «полуконтактным» методом в буфере, изображение (б) получено «полуконтактным» методом на воздухе. 

Крепление ионами магния оказывается более слабым, и не подходит для измерения ДНК непосредственно в буферном растворе. Однако выдержка свежесколотой слюды  в воде перед нанесением препарата способствует  более сильному связыванию молекул ДНК со слюдой [5]. О силе связывания можно судить по форме молекул: релаксированная форма (рис. 2а) говорит о наличии двумерной диффузии молекул вдоль поверхности слюды и, следовательно, о слабом связывании, скрученность (рис. 2б) указывает на непосредственный захват молекул при касании поверхности [5].

а б
Рис 2.  Молекулы ДНК, нанесенные из одного препарата на свежесколотую слюду (а) и на слюду, обработанную водой (б). Изображения получены «полуконтактным» методом на воздухе.


2. Модификация поверхности слюды 3-аминопропилтриэтокси силаном (APTES) [6].
На поверхности слюды формируют пленку APTES, которая в воде имеет положительный заряд. Для этого образцы свежеочищенной слюды помещают в эксикатор в присутствии APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) и DIPEA (N,N-Disopropylethylamine) и инкубируют в атмосфере аргона в течение 2 часов при комнатной температуре.  На подготовленную таким образом подложку наносят раствор ДНК, не добавляя в буфер ионы металлов. Образцы пригодны для измерений на воздухе и в воде. В отличие от образцов, приготовленных с помощью ионов металлов, на образцах приготовленных этим способом молекулы ДНК более скручены (Рис. 3).

 


Рис 3. Плазмидная ДНК на силанизированной слюде. Изображение получено «полуконтактным» методом в воде.


3. Модификация поверхности слюды поли-L-лизином (poly-L-lysine).
На свежеочищенную поверхность слюды наносят каплю 0.01% раствора поли-L-лизина с молекулярным весом 30000-70000, инкубируют 15 минут во влажной камере, промывают в воде и сушат. ДНК наносят и измеряют непосредственно в буфере, не высушивая образец, либо после промывки высушивают и измеряют на воздухе. Этот способ приготовления обеспечивает надежное связывание, но приводит к сильной конденсации молекул – большая часть молекул образует конденсаты цветочной или палочкообразной формы (Рис. 4).

 


Рис 4. Плазмидная ДНК на слюде, обработанной поли-L-лизином. Изображение получено «полуконтактным» методом на воздухе.


Как видно из рисунков, форма молекул ДНК на поверхности слюды существенно зависит от способа приготовления образца. Используя различные протоколы приготовления образца, из одного и того же препарата можно получить как полностью релаксированные молекулы, так и сильно сконденсированные.  Это следует учитывать при проведении исследований и выбирать протокол, наиболее соответствующий условиям научной задачи. В частности, соли двухвалентных металлов целесообразно использовать в тех исследованиях, в которых необходимо получить расправленную молекулу (например, при изучении ДНК-белковых комплексов и картировании ДНК), а модификация слюды силаном или поли-L-лизином более подходит для исследования процессов конденсации молекул ДНК.

Литература 1. Малюченко, Н.В., Тоневицкий, А.Г.,  Савватеев, М.Н. et al , Биофизика, т. 48, вып. 5, стр. 830-836, 2003.
2. Savvateev, M.N., Kozlovskaya, N.V., Moisenovich, M.M. et al, AIP Conference Proceedings, V. 696, p. 428, 2003.
3. Savvateev, M.N., application note “AFM study of macromolecules' structure and organization”, Интернет сайт компании НТ-МДТ (www.ntmdt.ru).
4. Hansma, H.G., Laney, D.E., Biophys J., 70(4), pp. 1933-1939, 1996.
5. Rivetti, C., Guthold, M. and Bustamante, C., J. Mol. Biol. V. 264, pp. 919–932, 1996.
6. Lyubchenko, Y.L., Gall, A.A., Shlyakhtenko, L.S., Harrington, R.E., Oden, P.I., Jacobs, B.L. and Lindsay, S.M., J. Biomolec. Struct. Dyn., V. 9, pp. 589-606, 1992.

 
 
Copyright © 2015 - 2017, NT-MDT SI