СЗМ Раман Нано ИК системы
Модульные СЗМ
Автоматизированные СЗМ
Специализированные СЗМ
 
 

Примеры применений (Архив)

Разработки и методы СЗМ для биологических применений.

Разработки и методы СЗМ для биологических применений.
 
В настоящее время СЗМ является широко используемым прибором для биологических исследований. Основным преимуществом СЗМ является возможность использования биологических объектов в жидкости с молекулярным разрешением. Применение СЗМ в биологических исследованиях приводит к определенным требованиям к конструкции прибора. СЗМ производства NT-MDT подразделяются на два класса, отличающиеся способом сканирования: сканированием образцом (SOLVER P47) и сканированием зондом (измерительная головка SMENA). Оба типа приборов обладают возможностью проведения измерений в жидкости с использованием контактного и прерывисто-контактного методов. Возможность измерений в жидкости является важной характеристикой для биологических применений. Для реализации прерывисто-контактного метода в жидкости используется акустическое возбуждение колебаний зонда. Наиболее удобной конструкцией для работы с биологическими образцами обладает измерительная головка (ИГ), которая позволяет использовать стандартную чашку Пери в качестве жидкостной ячейки открытого типа (Рис.1). ИГ SMENA позволяет также проводить измерения в капле жидкости (Рис.2) и в жидкостной ячейке закрытого типа. СЗМ P47 работает в жидкости только с использование закрытой ячейки [1]. Переход от измерений на воздухе к измерениям в жидкости с ИГ SMENA производится заменой магнитного держателя зонда (Рис.1) [2]. Такая конструкция  легка в использовании и позволяет легко очищать держатель зонда.

Рис. 1 ИГ SMENA для измерений в жидкости


Рис. 2 Схематический вид сканирования в капле жидкости с использованием ИГ  SMENA.

Для биологических приложений весьма важна возможность проведения измерений на живых объектах. В процессе измерений живого объекта температура должна поддерживаться постоянной (обычно около 37°C). Существуют два различных пути для проведения таких экспериментов с ИГ SMENA:

  1. использование закрытой жидкостной ячейки с контролем температуры,
  2. использование защитного кожуха, покрывающего прибор целиком и снабженного системой нагрева.
Первый путь более удобен вследствие быстроты процессов нагрева-охлаждения и лучшего доступа к прибору. Закрытая ячейка применяется также для проведения измерений в разных растворах. Измерения в закрытой ячейке могут проводиться не только в жидкости, но и в газе. Использование гелия в качестве позволяет повысить добротность кантилевера и уменьшить адсорбцию на поверхности образца.

Имеется две различные конфигурации СЗМ производства NT-MDT, основанные на применении ИГ SMENA и предназначенные для биологических измерений в жидкости:

1) СЗМ для исследования отдельных молекул, вирусов и др. объектов нанометровых размеров.

Исследования этих объектов на молекулярном уровне требуют улучшения шумовых характеристик прибора. Стандартная конфигурация приборов NT-MDT SOLVER P47H, SOLVER P47 включает подвесную виброзащитную систему (Рис.3), обеспечивающую минимальный шум в процессе сканирования. SOLVER P47H с ИГ SMENA для работы в жидкости более пригодна для биологических исследований с молекулярным разрешением как в жидкости, так и на воздухе.

 

Рис. 3 Пассивная виброзащитная система, ИГ SMENA и автоматизированная система подвода
(SOLVER P47H).

Минимальный шум может быть также достигнут использованием сканера с уменьшенным Z-диапазоном, что приводит к уменьшению шума в Z-направлении. Производимые NT-MDT сканеры с XYZ областью сканирования  до 50 мкм x 50 мкм x 2.5 мкм наиболее пригодны для образцов молекулярного масштаба. is more suitable for molecular-scale samples. Существуют два различных класс малых объектов, имеющих различные латеральные размеры. Например, молекулы обладают различными конформациями: длинные молекулы (например,  ДНК, Рис. 4а) и глобулярные молекулы (например,  растительный токсин ML1, Рис. 4 б). Измерения ДНК требуют большого XY диапазона в несколько десятков микрометров, в то время как измерения глобулярных молекул могут быть проведены на относительно малых участках с использованием сканеров с небольшим  XY диапазоном. Меньший XY диапазон позволяет осуществлять более точное XY позиционирование сканера, что также приводит к улучшению разрешения.

 

а)

б)

 

Рис. 4 Изображения были получены с использованием полуконтактного метода.
a) агрегация молекл ДНК, изображения было получено в спирте,
б) полученное на воздухе изображение растительного токсина
ML1 на слюде. Видны единичные молекулы.

2) СЗМ для клеток, бактерий, тканей.

Большие объекты подобно клеткам и тканям представляют второй тип биологических объектов, области исследования которых характеризуются латеральными размерами в несколько десятков микрометров и высотами от единиц до десятков микрометров. Для таких больших объектов NT-MDT разработала комбинацию инвертированного оптического микроскопа (Olympus или Biolam) и СЗМ на основе ИГ SMENA (Рис. 5) [3]. Это комбинированное устройство (Solver BIO) обеспечивает одновременные измерения СЗМ с высоким разрешением и широко используемыми оптическими методами, в том числе такими как методы фазового контраста и флуоресценции.

Рис. 5 SOLVER BIO: комбинация оптического микроскопа и СЗМ SMENA для работы в жидкости.

Примером изображения большого объекта является изображение мышиный фибробласта 3T3, зафиксированного формалином и находившегося в фосфатном буферном растворе (Рис. 6). СЗМ для изучения таких объектов должен содержать сканер с большим диапазоном сканирования по XYZ. Специальный блок электроники обеспечивает увеличение Z диапазона более чем в два раза сравнительно со стандартным электронным блоком. С этим блоком для сканера с XY диапазоном сканирования 90 мкм x 90 мкм Z-диапазон составляет около 10 мкм.

Рис. 6 Мышиный фибробласт в буферном фосфатном растворе. На левом рисунке виден цитоскелет. На правом рисунке видны складки, обусловленные движением клетки.

Инвертированный оптический микроскоп совмести также с ближнепольным сканирующим оптическим микроскопом Solver SNOM, который позволяет использовать традиционные для биологов оптические методы с разрешением лучше чем 100 нм (Рис. 6). Этот прибор позволяет получать рельеф и спектральные характеристики образца одновременно, причем как на воздухе, так и в жидкости. Например, можно получить информацию о распределении по поверхности образца маркированных молекул.

Рис. 7 Поперечно-силовое изображение ДНК, полученное на воздухе с помощью SOLVER SNOM.

Комбинация оптический микроскоп-СЗМ (или оптический микроскоп-БОМ) может быть снабжена сканирующим предметным столик с обратной связью. Такой столик обладает высокой линейностью, точностью и воспроизводимостью сканирования.

Все производимые NT-MDT СЗМ работают под управлением программного обеспечения, обладающего широкими возможностями манипулирования зондом. В частности, имеется возможность измерения силовых кривых в каждой точке сканируемого участка и затем провести анализ полученных данных (Силовое пространство (Force Volume), СП) . В настоящее время такая методика широко распространена в биологии (см.  СП анализ коллагеновых волокон). Если острие зонда покрыто определенными молекулами, то можно построить распределение взаимодействия зонд-образец. Например, таким путем можно исследовать реакции антиген-антитело.

Ссылки:

  1. NT-MDT patent pending #2001109729.
  2. NT-MDT patent pending #2001109728.
  3. NT-MDT patent pending #2001113928.

Благодарности:

Авторы благодарят A.С. Элкади (Московский Государственный Университет), M.M. Мойсеновича, A.Г. Тоневицкого (Институт Транплантологии, Москва), A.A. Маныкина  (Институт Вирусологии, Москва) за предоставленные образцы.

 

 
 
Copyright © 2015 - 2017, NT-MDT SI