3.1 «Классическая» оптическая микроскопия

Введение.

Термин, сформулированный в названии, является достаточно неопределенным. Развитие оптических методов в микроскопии привело к настоящему времени к появлению огромного числа методик, многие из которых следовало бы отнести к классическим. Однако целью данной главы является не обзор широких возможностей оптической микроскопии, а определение ряда терминов, которые далее будут использоваться при объяснении принципа функционирования конфокального микроскопа. Введение этих основных понятий мы выполним на примере микроскопа с широким полем зрения (рис. 1).

Рис. 1. Схема "классического" оптического микроскопа с широким полем зрения.

В таком микроскопе определенное поле зрения равномерно освещается световым пучком, затем оптическая система проецирует изображение объекта, находящегося в поле зрения на сетчатку глаза или на плоскость фотоприемника, например, ПЗС матрицы в видеокамере. При этом, вообще говоря, в фотоприемник попадает свет, испущенный из различных областей образца: как находящихся в фокусе объективной линзы, так и вне фокуса (рис. 2).

Рис. 2. В микроскопе с широким полем зрения одновременно видны различные точки образца, при этом точки из плоскостей отличных от предметной будут создавать фоновую засветку, снижающую контрастность.

Числовая апертура и безразмерные единицы.

В оптике принят ряд специализированных терминов для описания свойств оптических инструментов. В частности под числовой апертурой понимают

(1)

где – коэффициент преломления среды, а – угол полураствора конуса в котором сходится или расходится свет. Для линзы этот угол определяется диаметром ее оправы и фокальным расстоянием :

(2)

Для удобства расчетов нам будет удобно измерять расстояния от оси в плоскости объекта в единицах длины волны света в среде , где – длина волны света в вакууме. Безразмерная единица радиуса будет иметь вид

(3)

а безразмерное расстояние вдоль оптической оси будет равно

(4)

Чем определяется разрешение микроскопа?

Изображения, получаемые при помощи линз или зеркал, располагаются в геометрически сопряженных плоскостях. В этом случае для пучка лучей, распространяющегося от каждой точки объекта, выполняется условие дифракции Фраунгофера. Пусть, например, параллельный пучок света от далекого точечного объекта, сходится в фокальной плоскости линзы (рис. 3).

Рис. 3. Дифракция Фраунгофера в фокальной плоскости линзы.

Каждая точка фокальной плоскости соответствует бесконечно удаленной точке; следовательно, в фокальной плоскости выполняется условие дифракции Фраунгофера. Роль препятствия, на котором свет испытывает дифракцию, играет диафрагма , ограничивающаяся световой пучок. Такой диафрагмой, в частности, может являться оправа самой линзы. Принято говорить, что дифракция происходит на входной апертуре оптической системы.

Аналогичным образом можно проиллюстрировать случай, когда точечный источник находится на конечном расстоянии от линзы, а изображение возникает на расстоянии за линзой. При этом расстояния и подчиняются формуле линзы

(5)

Для того, чтобы пояснить, почему и в этом случае выполняется условие наблюдения дифракции Фраунгофера, заменим одиночную линзу с фокусным расстоянием двумя вплотную расположенными линзами с фокусными расстояниями и (рис. 4). Тогда источник оказываются расположенными в переднем фокусе первой линзы, а плоскость изображения совпадает с задней фокальной плоскостью второй линзы. При этом автоматически выполняется соотношение (5), так как оно равносильно правилу сложения оптических сил (то есть обратных фокусных расстояний) двух близко расположенных линз. В промежутке между линзами лучи идут параллельным пучком. Сравнивая рис. 3 и 4, можно заключить, что во втором случае дифракция Фраунгофера происходит на общей оправе линз и наблюдается в задней фокальной плоскости второй линзы. Рис. 3 соответствует картине дифракции света в объективе телескопа (или глаза), рис. 4 – дифракции в объективе микроскопа. Поле зрения обычных оптических микроскопов не превышает 1000 разрешаемых элементов.

Рис. 4. Дифракция Фраунгофера в плоскости, геометрически сопряженной источнику.

Функция размытия точки (point spreading function).

Функция размытия точки (PSF) (или функция импульсного отклика дифракционно-ограниченной системы) определяет распределение интенсивности в фокальной плоскости линзы обусловленное дифракцией Фраунгофера на входной диафрагме. Как показано выше, точно такое же распределение интенсивности получится от точечного источника в сопряженной плоскости тонкой линзы.

PSF для линзы с фокальным расстоянием от пучка ограниченного круглой диафрагмой диаметром может быть выражено в общем виде [2]:

(6)

где

(7)

где – функции Бесселя k-го порядка, .

Здесь мы ввели более общую функцию, чем было определено ранее. Функция дает распределение интенсивности вдоль радиуса для различных плоскостей . Эта функция обладает замечательным свойством: для любой плоскости

(8)

что отвечает постоянству потока энергии через каждую плоскость.

В параксиальном приближении (малые значения распределение интенсивности света в фокальной плоскости определяется выражением

(9)

где нормировочный коэффициент выбран так, чтобы в фокусе значение было равно 1.

Картина дифракции на круглом отверстии имеет вид концентрических колец. Центральное светлое пятно носит название пятна Эйри. Интенсивность в максимуме первого светлого кольца составляет приблизительно 2 % от интенсивности в центре пятна Эйри. Распределение показано на рис. 5.

Рис. 5. Распределение интенсивности в дифракционной картине круглой диафрагмы.

При этом радиус пятна Эйри составляет

(10)

или

(11)

где .

Следует заметить, что на оптической оси системы : и , поэтому разрешение вдоль оптической оси определяется только вкладом . В параксиальном приближении (малые значения ) относительное изменение интенсивности вдоль оси

(12)

Разрешающая способность микроскопа, критерий Релея.

Под разрешающей способностью микроскопа обычно понимают возможность различения двух близких по интенсивности точечных объектов. Из вида функции распределения интенсивности в фокальной плоскости следует, что разрешение будет определяться степенью перекрытия пятен Эйри распределений двух точечных объектов. Релеем был предложен критерий, согласно которому две точки считаются разрешенными, если величина "провала" в интенсивности по центру между изображениями точек составили 26% от максимума. При этом расстояние между разрешаемыми точками должно быть больше радиуса пятна Эйри (см. предыдущий параграф).

Выводы.

Основная характеристика объективной линзы – ее числовая апертура, которая определяется диаметром оправы и фокусным расстоянием.
Разрешение обычного оптического микроскопа определяется дифракцией Фраунгофера на входной диафрагме объективной линзы. Минимальное расстояние между разрешаемыми точечными объектами одинаковой интенсивности равно радиусу пятна Эйри.
В данном разделе получено выражение для функции размытия точки (или функции импульсного отклика дифракционно-ограниченной системы), которое будет использовано в дальнейшем при объяснении принципа работы конфокального микроскопа.

Литература.

Robert H. Webb, "Confocal optical microscopy" Rep. Prog. Phys. 59 (1996) 427-471.
Richards B. and Wolf E., "Electromagnetic diffraction in optical systems II. Structure of the image field in an aplanatic system" Proc. R. Soc. A 253 (1959) 358-379.